河南师范大学--淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用虚拟仿真实验教学项目

北京欧倍尔淀粉酶高产菌的筛选、诱变、鉴定及应用虚拟仿真实验教学项目，以淀粉酶产生菌的筛选、诱变、鉴定及应用为例，培养学生掌握从自然界中分离产酶微生物，并筛选高效产酶菌株的科学方法，并能够熟练操作菌种筛选、无菌操作、酶活测定、菌种诱变、DNA提取及PCR扩增、电泳、生物信息学分析、中试生产等一系列实用专业技术。

整个实验过程包括四个模块：

模块一：淀粉酶产生菌的筛选

淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质，并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖。淀粉酶产生菌能利用淀粉作为唯一碳源生存，通过淀粉选择性培养基可筛选得到。淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。功能性平板筛选具有简便、快速并节约大量时间等优良特性，但难以得到确切产量水平，只适合初筛。初筛具有不稳定性，有必要进行摇瓶复筛，定量确定表达水平，获得优良性状菌株。淀粉-碘复合物在660 nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定淀粉酶的活力。利用该反应，测定不同淀粉酶产生菌的酶活力可选出优良的淀粉酶产生菌。

培养基灭菌

培养基制作

模块二：淀粉酶高产菌的诱变选育

对淀粉酶产生菌株进行诱变选育，可进一步提升其产酶能力。DNA于260 nm有最大能量吸收峰，通过与15 W紫外灯近距离紫外照射，会吸收大量能量造成DNA分子发生断裂、分子结构形式发生改变。经过修复，DNA碱基发生了改变从而形成了突变株，有些突变株产酶水平提高（正突变），而有些突变株产酶水平降低（负突变）。检测突变株的产酶能力可获得产酶力更强的菌株。

紫外照射诱变

模块三：淀粉酶产生菌的菌种鉴定

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到分子水平。16S rDNA长度在1.5 kb左右，包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能反映物种间的差异。因16S rDNA分子大小适中，突变率小，故成为细菌系统发育和分类鉴定最常用的标签。其序列较为适合PCR扩增，又具有保守性和普遍性等特点，序列分析的重现性较高，同时序列变化与进化距离相适应，因此，现在一般普遍采用16S rDNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。主要包括：提取淀粉酶筛选菌的基因组DNA，进行16S rDNA扩增、琼脂糖凝胶电泳分离、回收、测序，通过NCBI核苷酸数据库序列比对，判定筛选菌的种属。

NCBI核苷酸数据库

PCR扩增

模块四：淀粉酶高产菌的中试生产

将诱变得到的高产淀粉酶的菌株接种于富含淀粉的培养基中诱导发酵产生淀粉酶。整个实验按照“菌种培养、空消、实消、接种、发酵、放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，通过培养基的制备、种子的扩大培养和罐体的灭菌为中试发酵生产做准备；在发酵时，控制好转速、消泡、pH、温度、溶解氧和补料等各项参数，防止杂菌污染。密切关注pH值、酶活、溶解氧残糖量及生物量等指标。最后分析观察整个发酵过程淀粉酶以及各物质的生成和消耗的变化规律，对于如何调整培养条件来提高发酵生产的效率和中试生产具有重要的指导意义。                

中试生产